Abstract:

BACKGROUND: Inherited skeletal muscle diseases are genetically heterogeneous diseases caused by mutations in more than 150 genes. This has made it challenging to establish a high-throughput screening method for identifying causative gene mutations in clinical practice.
AIM: In the present study, we developed a useful method for screening gene mutations associated with the pathogenesis of skeletal muscle diseases.
METHODS: We established four target gene panels, each covering all exonic and flanking regions of genes involved in the pathogenesis of the following muscle diseases: (1) muscular dystrophy (MD), (2) congenital myopathy/congenital myasthenic syndrome, (3) metabolic myopathy and (4) myopathy with protein aggregations/rimmed vacuoles. We assigned one panel to each patient based on the results of clinical and histological analyses of biopsied muscle samples and performed high-throughput sequencing by using Ion PGM next-generation sequencer. We also performed protein analysis to confirm defective proteins in patients with major muscular dystrophies. Further, we performed muscle-derived cDNA analysis to identify splice-site mutations.
RESULTS: We identified possible causative gene mutations in 33% of patients (62/188) included in this study. Our results showed that the MD panel was the most useful, with a diagnostic rate of 46.2%.
CONCLUSIONS: Thus, we developed a high-throughput sequencing technique for diagnosing inherited muscle diseases. The use of this technique along with histological and protein analyses may be useful and cost-effective for screening mutations in patients with inherited skeletal muscle diseases.

日本語要旨:

2014-2015年に筋病理診断目的で国立精神・神経医療研究センターに筋検体、血液検体が送付され、遺伝性筋疾患が疑われたものの原因遺伝子が未確定の孤発例188例を、筋病理所見に基づき筋ジストロフィー(MD,65例)、先天性ミオパチー／先天性筋無力症候群(CMP/CMS, 65例)、代謝性ミオパチー(MM, 10例)、筋原線維性ミオパチー／縁取り空胞を伴うミオパチー(MFM, 48例)の4グループに分類した。各疾患群に関連した遺伝子のエクソン、エクソン・イントロン境界をカバーする4つのターゲット遺伝子パネルを作製し、それらを用いてIonPGM次世代シークエンサーで遺伝子解析を行った。また、MDが疑われた患者では、主要なMDの原因蛋白について免疫組織化学を行った。更に、スプライス部位の変異については、筋由来のcDNAを用いてスプライシング異常の評価を行った。各パネルで解析を行ったところ、MD 30例(46.2%)、CMP 17例(26.2%)、MM 3例(30%)、MFM 12例(25%)で候補遺伝子変異を見出した。全118患者での診断率は33.0%であった。機能喪失型の機序が想定される遺伝子に変異を認めた筋ジストロフィー患者の免疫組織化学では、蛋白の欠失や局在異常が確認された。また、イントロン領域に変異を認めた患者では、cDNA解析にて異常なスプライシングが起こっていることを確認した。我々の筋病理、mRNA、蛋白解析を併用した遺伝子診断法は、筋疾患患者における病的バリアントのスクリーニングに有用かつ効率が良い方法と考えられた。今回の研究の結果は、包括的な疾患関連の遺伝子変異データベースを発展させること、臨床、病理、分子学的実験など、多面的な評価が重要であることを示している。